Selección de aptámeros antibacterianos contra la proteína BamA en Pseudomonas aeruginosa mediante la incorporación de un algoritmo genético para optimizar el método de detección computacional

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7582 (2023) Citar este artículo

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La resistencia a los antibióticos es una de las mayores amenazas para la salud mundial, lo que provoca que un número cada vez mayor de personas sufran enfermedades graves o mueran debido a infecciones que antes eran fácilmente curables con antibióticos. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno importante que ha desarrollado rápidamente resistencia a los antibióticos y la OMS ha clasificado este patógeno en la lista crítica. Los aptámeros de ADN pueden actuar como candidatos potenciales para nuevos agentes antimicrobianos. En este estudio, demostramos que un aptámero existente puede afectar el crecimiento de P. aeruginosa. Se llevó a cabo una selección computacional de aptámeros que podrían unirse a una proteína de membrana externa esencial y bien conservada, BamA, en bacterias Gram-negativas. El acoplamiento molecular de aproximadamente 100 aptámeros de ADN funcionales con la proteína BamA se realizó a través de enfoques de acoplamiento locales y globales. Además, se llevó a cabo un análisis de algoritmos genéticos para clasificar los aptámeros en función de su afinidad de unión. Los principales éxitos de los aptámeros con buena unión a la proteína BamA se sintetizaron para investigar su actividad antibacteriana in vitro. Entre todos los aptámeros, Apt31, que se sabe que se une a un antitumoral, la daunomicina, exhibió la puntuación más alta de HADDOCK y resultó en una reducción significativa (p < 0,05) en el crecimiento de P. aeruginosa. Apt31 también indujo la ruptura de la membrana que resultó en una fuga de ADN. Por lo tanto, la selección computacional puede resultar en la identificación de aptámeros que se unen al sitio activo deseado con alta afinidad.

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria oportunista Gram-negativa que causa muchas infecciones nosocomiales y es un patógeno importante en los pulmones con fibrosis quística de los pacientes infectados. Además, también se asocia con otras infecciones adquiridas en el hospital, como la neumonía asociada al ventilador, la infección relacionada con el catéter urinario, la infección quirúrgica/trasplante y muchas más1. Recientemente, también se encontró que P. aeruginosa es el segundo patógeno más frecuentemente detectado en pacientes con COVID-19 que causa coinfección2,3,4. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha clasificado este organismo mortal como un patógeno ESKAPE, y también está categorizado en la Prioridad 1: Lista crítica debido a la aparición de cepas multirresistentes (MDR). Las infecciones causadas por P. aeruginosa son cada vez más difíciles y casi imposibles de tratar donde ciertas cepas desarrollaron resistencia a casi todos los antibióticos actualmente disponibles, incluso al tratamiento de último recurso, aumentando así la tasa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo5. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de descubrir nuevos agentes antimicrobianos para superar esta crisis sanitaria mundial.

La producción de antibióticos es costosa y laboriosa, ya que un antibiótico tarda casi 10 años en llegar al mercado, pero las bacterias pueden tardar hasta 11 días en desarrollar resistencia a él6. Por lo tanto, se debe considerar un enfoque alternativo para prevenir la pobreza global causada por la resistencia a los antimicrobianos (RAM). La reutilización de fármacos, que también se conoce como reposicionamiento de fármacos o reperfilado de fármacos, ha recibido recientemente una enorme atención en la industria farmacéutica, ya que descubrir nuevas indicaciones terapéuticas de fármacos ya existentes puede reducir el tiempo y el coste del desarrollo de fármacos. La seguridad y la toxicidad de los medicamentos reutilizados también han sido bien estudiadas y, por lo tanto, pueden considerarse seguras para nuevos usos terapéuticos. Por lo tanto, la reutilización de aptámeros puede reducir el costo y la duración del descubrimiento de nuevos aptámeros y el desarrollo de fármacos. Los aptámeros se han convertido en herramientas prometedoras para el diagnóstico y la terapéutica en el campo de la microbiología. Los aptámeros son oligonucleótidos (ADN/ARN) monocatenarios cortos plegados que pueden unirse específicamente y formar complejos con dianas moleculares como las proteínas7. Esta unión puede provocar efectos terapéuticos y muchos aptámeros terapéuticos ya se están sometiendo a ensayos clínicos. Por ejemplo, Macugen es un aptámero aprobado por la FDA y disponible en el mercado como medicamento para tratar la degeneración macular7. Los aptámeros son posibles agentes antimicrobianos, ya que son rentables y, lo que es más importante, poseen varias ventajas sobre los anticuerpos y los antibióticos, como baja inmunogenicidad, breve plazo de producción y alta estabilidad8. Los aptámeros también son flexibles para modificaciones estructurales y químicas, lo que eventualmente amplía sus aplicaciones clínicas8. Además, la identificación de objetivos adecuados en bacterias para la unión de aptámeros también es importante porque la baja permeabilidad de la capa de la membrana externa en bacterias Gram-negativas es una de las principales razones para el desarrollo de AMR9. Por lo tanto, el objetivo elegido debe ser fácilmente accesible sin necesidad de atravesar la capa de membrana externa de baja permeabilidad en P. aeruginosa y, por lo tanto, las proteínas de la membrana externa pueden ser los objetivos potenciales.

BamA es un componente del complejo de maquinaria de ensamblaje de barril β (BAM), un complejo que inserta proteínas de barril β en la membrana externa. Se encontró que BamA es el componente central del complejo BAM y está altamente conservado en especies bacterianas Gram-negativas, así como también está expuesto a la región extracelular10. BamA es vital para la viabilidad celular y el crecimiento bacteriano, por lo que su inhibición mostró actividad antibacteriana en muchas bacterias Gram-negativas11. La formación de la puerta lateral por la cadena β 1 (β1) y la cadena β 16 (β16) en BamA es importante para la unión de las proteínas nacientes de la membrana externa a BamA12. Las proteínas nacientes entran por la puerta lateral, se pliegan y ensamblan y salen por el poro de BamA. Por lo tanto, dirigirse a la puerta lateral en BamA puede inhibir el crecimiento y la supervivencia bacterianos. La darobactina es un antibiótico aislado de la bacteria Photorhabdus que puede matar eficazmente muchas bacterias Gram-negativas al inhibir la actividad de BamA13,14. Desafortunadamente, ningún estudio ha explorado la unión de aptámeros a BamA para inhibir el crecimiento bacteriano. Presumimos que la unión de aptámeros a la puerta lateral en la proteína BamA evitará el ensamblaje y la inserción de proteínas de barril β en la membrana externa, lo que provocará la muerte celular.

Los aptámeros generalmente se seleccionan a través de un método de selección in vitro largo y laborioso conocido como evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX). El enfoque computacional de detección de drogas está ganando popularidad entre los investigadores porque ahorra tiempo, es rentable y confiable. Muchos estudios han demostrado que los métodos in silico SELEX podrían impulsar de manera eficiente el diseño y la selección de aptámeros a nuevas alturas, además de ahorrar tiempo y ser rentables15,16,17. Esto se alinea con la creciente atención que reciben los métodos bioinformáticos in silico, ya que se han propuesto, intentado y probado varios enfoques para el diseño computacional y la selección de aptámeros, a la vez que brindan muchos beneficios. El acoplamiento molecular se emplea a menudo para caracterizar y simular las afinidades de unión y las propiedades estructurales de los complejos, una práctica común antes de los experimentos in vitro, lo que ahorra tiempo y trabajo. Por lo tanto, los estudios de diseño de fármacos favorecen las simulaciones de acoplamiento, y desde entonces se han desarrollado varios algoritmos, como HADDOCK, ZDOCK, HDock, AutoDock, AutoDock Vina, Rosetta y muchos más18,19. Sin embargo, algunos estudios han advertido que se requiere más trabajo para analizar los complejos de unión, a pesar de encontrar su mejor estructura respectiva20. Esto se debe a la variación de las puntuaciones de unión entre los diferentes programas de acoplamiento, incluidas algunas que poseen puntuaciones que no pueden tomarse como la "afinidad de unión verdadera", ya que algunas no están calibradas con datos experimentales.

Hasta la fecha, muchos métodos propuestos de análisis computacional de la estructura y propiedades de los aptámeros han demostrado su eficacia. Por lo tanto, para minimizar los errores en este campo, el software y los algoritmos más potentes y eficientes siempre serán relevantes, en particular el aprendizaje automático y las técnicas de inteligencia artificial que han despertado interés recientemente. La aplicación de técnicas de aprendizaje automático y aprendizaje profundo para el descubrimiento y la selección de aptámeros ha comenzado a evolucionar21,22,23. Juntos, estos factores requieren estudios de casos adicionales, experimentos y, posteriormente, revisiones sistemáticas y actualizadas19.

Los algoritmos de búsqueda estocástica que se utilizan a menudo en aplicaciones de aprendizaje automático, como los algoritmos genéticos (GA), pueden ofrecer una solución a algunos desafíos en los métodos de selección computacional. Los AG se refieren a algoritmos matemáticos que se inspiraron en la idea de selección natural de Charles Darwin, según la cual el algoritmo solo conserva a los individuos más aptos a lo largo de las diferentes generaciones24. Uno de los propósitos de GA era utilizar una serie de variables o vectores (o genes en términos de GA) para crear un modelo de predicción y encontrar soluciones aproximadas o casi exactas para problemas de optimización y búsqueda25. El concepto de GA consiste en combinar diferentes valores en cada generación para extraer la mejor combinación de valores en cada variable para crear nuevos individuos con la mayor aptitud24. Para los propósitos de este estudio, en lugar de usar GA para utilizar secuencias y datos estructurales en la búsqueda del aptámero de mejor desempeño, usaremos características operacionalizadas en vectores, alimentando GA para obtener aptámeros candidatos.

Por lo tanto, en este estudio, aplicamos un enfoque in silico para seleccionar aptámeros de un conjunto de datos existente, que consta de aptámeros de ADN funcionales publicados que se sabe que se unen a varios objetivos, que también se unen a la proteína BamA en P. aeruginosa según el acoplamiento molecular. y análisis de algoritmos genéticos. Determinamos además su actividad antibacteriana a través de ensayos in vitro. El objetivo principal de este estudio es reutilizar los aptámeros disponibles como nuevos agentes antibacterianos dirigiéndose a la proteína esencial de la membrana externa a través de métodos rentables y menos laboriosos.

Hasta la fecha, no se dispone de un modelo estructural de la especie BamA de Pseudomonas. Aunque la proteína BamA se conserva entre las especies de bacterias Gram-negativas, Pseudomonas tiene una distancia genética mayor que otras bacterias como Escherichia coli, Salmonella y Shigella26,27. Por lo tanto, se construyó un modelo universal de Pseudomonas BamA. La alineación de secuencias múltiples se realizó con COBALT (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) con las 100 secuencias de aminoácidos de Pseudomonas BamA disponibles de 37 especies (consultado el 20 de marzo de 2022). Luego se derivó una secuencia consenso de BamA. Se utilizó el software Modeller 10v1 (https://salilab.org/modeller/) para construir el modelo basado en algunas plantillas de PDB (5d0oA, 6lyqA y 5aywA). Las plantillas se eligieron basándose en el mayor porcentaje de similitud de las secuencias de aminoácidos con la secuencia consenso de Pseudomonas BamA. Se utilizaron el perfil de puntuación de energía proteica optimizada discreta (DOPE), el valor RMSD, el gráfico de Ramachandran y el análisis PROCHECK para validar el modelo construido de Pseudomonas BamA. El acoplamiento molecular entre el modelo Pseudomonas BamA y Darobactin, el conocido inhibidor de BamA, se llevó a cabo utilizando el servidor web HADDOCK 2.4 (https://wenmr.science.uu.nl/haddock2.4/) para determinar su sitio de unión putativo. El modelo acoplado se comparó con el modelo BamA experimental unido a darobactina disponible de la base de datos PDB (7P1C).

Las secuencias de aptámeros de ADN funcionales sin modificación ni en las bases ni en el esqueleto se obtuvieron del conjunto de datos 'Heredia F. DNA/Aptamer' (https://data.mendeley.com/datasets/76jgjbgndr/1)28,29. Estos datos se extrajeron previamente de la base de datos en línea Aptagen mediante un script de python28. Se seleccionaron aptámeros de ADN sin modificaciones porque el ADN es más estable en comparación con el ARN y los aptámeros no modificados se pueden sintetizar fácilmente a un costo menor en comparación con los aptámeros modificados. De las 238 secuencias de aptámeros, se usaron alrededor de 100 aptámeros para el acoplamiento con el modelo Pseudomonas BamA. Estas 100 secuencias de aptámeros se seleccionaron en función de múltiples criterios, como la longitud (20 a 100 pares de bases) y la ausencia de degeneración y modificaciones en las secuencias. La longitud ideal de los aptámeros debería estar entre 20 y 100 pares de bases. Los aptámeros cortos pueden no plegarse en una estructura definida, mientras que los aptámeros largos pueden no ser capaces de penetrar a través de las células bacterianas. Por lo tanto, solo se usaron aptámeros con 20 a 100 pares de bases para el acoplamiento. Las estructuras secundaria y terciaria de los aptámeros seleccionados se predijeron utilizando el servidor web UNAFold (http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form. php) y RNAComposer (https://rnacomposer.cs.put.poznan.pl/), respectivamente30.

El acoplamiento molecular entre la estructura 3D de los aptámeros y el modelo BamA de Pseudomonas se llevó a cabo utilizando el servidor web HADDOCK 2.4 (https://wenmr.science.uu.nl/haddock2.4/) que utiliza un método de acoplamiento local mediante el cual el activo y el es necesario especificar los sitios de unión de los ligandos31. Residuos en la puerta lateral de BamA (E401, S402, G403, S404, I405, T406, A407, S408, V409, G410, F411, E786, T787, Q788, V789, F790, Q791, F792, S793, L794, G795) fueron elegidos como los residuos activos en nuestro acoplamiento. Los complejos de acoplamiento con puntuaciones negativas de HADDOCK se consideran complejos más estables, mientras que una puntuación positiva de HADDOCK se considera menos estable y la unión puede ser energéticamente desfavorable. Los candidatos a aptámeros con la puntuación HADDOCK más negativa (baja) fueron preseleccionados para el análisis posterior. Se generaron complejos con una puntuación de HADDOCK menos negativa (alta) utilizando una secuencia de oligonucleótidos aleatoria para el acoplamiento molecular con BamA. Como tal, el oligonucleótido aleatorio, HTO008, se eligió como control negativo en función de la longitud, que es de aproximadamente 38 pares de bases. Finalmente, se llevó a cabo el análisis Residue Interaction Network Generator (RING) (https://ring.biocomputingup.it/submit)32 para identificar todo tipo de interacciones no covalentes a niveles atómicos en los complejos aptámero-BamA obtenidos de HADDOCK 2.4 servidor web, para demostrar qué tan fuerte pueden unirse los aptámeros a la región de puerta lateral de BamA. Además, también se realizó acoplamiento global para determinar los sitios de unión más favorables de los aptámeros y el control negativo en BamA. El servidor HDOCK (http://hdock.phys.hust.edu.cn/)33 se utilizó para el enfoque de acoplamiento global sin especificar los sitios activos. El acoplamiento en el servidor HDOCK se basa en un algoritmo híbrido de modelado basado en plantillas y acoplamiento libre ab initio. Los resultados del acoplamiento global se compararon con los modelos de acoplamiento locales y, en base a eso, se analizaron la clasificación del algoritmo genético y el ensayo antibacteriano. Con base en el análisis de acoplamiento local y global, se seleccionó el mejor aptámero con la puntuación de HADDOCK más negativa que se une a la región de la puerta lateral.

Para estudiar potencialmente las características apropiadas de una buena unión aptámero-BamA, se extrajo la puntuación de HADDOCK de 100 aptámeros acoplados contra BamA, y las cinco características o vectores de HADDOCK fueron puntuación HADDOCK, RMSD, puntuación Z, fuerzas de Van der Waals y energía electrostática. Esto se llevó a cabo clasificando e informando estadísticamente las distribuciones de cada vector HADDOCK por medio y límite superior-inferior.

Para proporcionar datos de entrada para un algoritmo genético, los vectores se normalizaron en función del % de 0 a 100 % debido a las distintas puntuaciones, valores y unidades en los cinco vectores. Por ejemplo, el rango de puntuación de HADDOCK fue de − 130 a + 60, mientras que la energía electrostática fue de − 676 a − 25. Los datos de salida de HADDOCK de los 100 aptámeros presentan los cinco vectores que influyen en el desempeño de un aptámero de unión con la proteína BamA. Para maximizar nuestras posibilidades de encontrar la mejor combinación de vectores de unión aptámero-BamA, que estaría presente en un aptámero de buen rendimiento, utilizamos un algoritmo genético para ayudar en esa búsqueda. Por lo tanto, aplicar un algoritmo genético con los mejores datos de vectores de aptámeros para resolver el problema de maximización u optimización requeriría puntajes máximos de vectores de los mejores aptámeros, que se clasificaron en función de los puntajes más negativos en HADDOCK y RMSD solo. Sin embargo, entre los vectores, se observó que la puntuación HADDOCK solo tiene valores distribuidos menos aleatorios, según la inspección visual del gráfico de coordenadas paralelas. Como los otros cuatro vectores tenían los mejores aptámeros en una distribución más aleatoria y distribuida en sus rangos de puntuación, sería más difícil y arriesgado asumir las puntuaciones más negativas como atributos de los aptámeros con mejor rendimiento en la interacción aptámero-BamA.

Se observó que no había puntajes estándar para ninguno de los cinco vectores, por lo que se asumió una suposición gaussiana para cada vector. Además, podría adoptarse un enfoque multimodal para asignar más de un modelo gaussiano para cada uno de los otros cuatro vectores (excluyendo la puntuación HADDOCK). El valor máximo de los resultados de los cálculos multimodales basados en la función de pertenencia gaussiana se utilizó para construir la función de aptitud.

Función de pertenencia gaussiana, en la que x = valor de entrada, σ = desviación estándar, c = media.

La implementación de un GA requiere una ecuación para cuantificar el objetivo que el algoritmo intenta alcanzar. Para operacionalizar el objetivo de optimización que logrará este GA, se empleó el modelo gaussiano para cuantificar nuestro objetivo de obtener la mejor distribución de puntuaciones en nuestros cinco vectores: puntuación HADDOCK (A1), RMSD (A2), fuerzas de Van der Waals (A3), energía electrostática (A4) y puntuación Z (A5). Generalmente, un algoritmo genético requiere cinco elementos: su población inicial, una función de aptitud, operadores de selección, mutación y cruce.

Esencialmente, una población inicial consta de valores aleatorios y puntajes de las características seleccionadas. Para este estudio, se incluyeron valores aleatorios de una escala de 0 a 100 %, ya que los cinco vectores se normalizaron en porcentajes. En cada vector, los cinco números aleatorios representan los genes en un cromosoma (o conjunto de números aleatorios), de los cuales los 'padres seleccionados' y la 'descendencia subsiguiente' se generan aplicando las operaciones de cruce y mutación. Un ejemplo de vector es el siguiente: [2.58, 1.886, 39.64, 60.94, 21.053].

Una función de aptitud se define simplemente como la función objetivo a optimizar. Se construye mediante la suma de cada valor en un vector, por lo que cada valor se modela a través de la respectiva función de pertenencia gaussiana. Por lo tanto, para que la función de aptitud genere nuevas soluciones basadas en los datos vectoriales de HADDOCK existentes, las mejores soluciones deben alcanzar un valor objetivo de 5. Y (solución) = A1 + A2 + A3 + A4 + A5. Los cinco vectores se codificarían como A1 (puntuación HADDOCK), A2 (RMSD), A3 (Van der Waals), A4 (energía electrostática) y A5 (puntuación z) respectivamente. Usando la función gaussiana, el GA tomaría el máximo de salidas posibles de cada vector y su función gaussiana y luego las sumaría para obtener un número cercano al resultado óptimo de 5.

Los algoritmos genéticos tienen funciones y comandos para mejorar su búsqueda de la mejor solución, conocidos como parámetros. Los parámetros típicamente usados son los siguientes: num_generations = 500 (número total de poblaciones en una sola corrida), sol_per_pop = 100 (solución a generar en cada población), parent_selecton_type = random (tipo de selección de padres en cada generación), keep_parents = 1 (número de padres a mantener en la población actual), tipo de cruce = punto_único (tipo de operación de cruce), tipo_mutación = aleatorio (tipo de mutación), número_mutación_genes = 1 (número de genes mutados por generación).

Basándose en la mejor distribución de los vectores HADDOCK, se utilizó la fórmula de la distancia euclidiana (√Σ(Ai-Bi)2) para clasificar y enumerar los 100 aptámeros en Excel, para observar qué tan cerca estaban los aptámeros de la 'mejor distribución'. El código de Excel es el siguiente: = SQRT(SUMXMY2('rango de filas de la mejor distribución', 'rango de filas de la distribución vectorial del aptámero específico)). 'SUMXMY2' toma la suma de las diferencias al cuadrado en los elementos correspondientes de los dos rangos, Ai y Bi. 'SQRT' encuentra la raíz cuadrada de SUMXMY2. El resultado final es la distancia euclidiana entre los dos rangos. Cuanto más pequeña es la distancia, más cerca están los vectores de HADDOCK del aptámero cerca de la mejor distribución para una buena unión aptámero-BamA.

Se utilizó la cepa bacteriana, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) como organismo diana. Las secuencias de aptámero seleccionadas fueron sintetizadas por la empresa Integrated DNA Technologies. Los medios Luria-Bertani (LB), el agar nutritivo (NA) y la solución salina tamponada con fosfato (PBS) se adquirieron de la marca HI-MEDIA.

Después de seleccionar los mejores aptámeros de unión, se llevó a cabo un ensayo antibacteriano in vitro. Se desnaturalizaron 100 μl de aptámero 20 μM en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X (pH ~ 7,4) y se renaturalizaron para el plegamiento de la estructura terciaria calentando a 95 °C durante 10 min seguido de enfriamiento lento usando un termociclador. Se recogió un cultivo de P. aeruginosa durante la noche con una densidad óptica (OD) de 1 a 600 nm y el sedimento celular se lavó con 1x PBS. Después del lavado, las células se centrifugaron a 13.000 rpm durante 5 min. A continuación, el sedimento celular se resuspendió con 100 μl de PBS seguido de la adición de 100 μl del aptámero plegado para obtener 10 μM de aptámero como concentración final. Se añadieron 100 μl de 1x PBS al grupo de control (sin tratamiento). Para la incubación de 0 h, se llevó a cabo una dilución en serie inmediatamente después de agregar aptámeros usando una pipeta multicanal y se colocaron 8 μl de células de la dilución 104 a 106 en la placa de NA. Luego, las bacterias se incubaron con los aptámeros durante 1 y 2 horas a 4 °C para retardar el crecimiento bacteriano y permitir la unión. Se llevaron a cabo placas puntuales para cada punto de tiempo y las placas se incubaron a 25 °C durante la noche seguida de 37 °C durante 5 h. Se analizó la unidad formadora de colonias (UFC/mL) para cada condición de aptámero y se repitió el experimento tres veces de forma independiente. Las UFC/mL y el porcentaje de crecimiento bacteriano se presentaron como gráficos de barras.

Las bacterias liberan su contenido citoplasmático, especialmente el ADN, debido a la pérdida de integridad de la membrana. Después de incubar las bacterias en diferentes condiciones de tratamiento durante 2 h, las bacterias de cada condición de tratamiento se centrifugaron a 13 000 rpm durante 5 min y se recogieron los sobrenadantes. A continuación, los sobrenadantes se purificaron con el kit de purificación FavorPrep GEL/PCR para eliminar los aptámeros, que son dos veces más pequeños que el tamaño de corte del par de bases de la membrana en la columna. Después de la purificación, los sobrenadantes solo deben contener el ADN genómico liberado por las células. La concentración de ADN se midió a 260 nm usando la máquina BioDrop µLITE y la concentración de ADN liberado en presencia de aptámeros se comparó con el grupo de control (sin tratamiento) para estudiar la integridad de la membrana.

Se realizaron al menos tres réplicas experimentales para todos los ensayos. Todos los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. Se llevó a cabo la prueba de Bartlett para evaluar la igualdad de la varianza en diferentes grupos, y se llevó a cabo ANOVA unidireccional ordinario con comparaciones múltiples para comparar los valores medios entre los grupos de control y tratamiento utilizando GraphPad Prism. El nivel de significación se fijó en p < 0,05.

Debido a la falta de disponibilidad del modelo BamA para las especies de Pseudomonas, se construyó un modelo universal de Pseudomonas BamA. La alineación de múltiples secuencias de la proteína BamA de alrededor de 37 cepas mostró que P. aeruginosa compartía aproximadamente un 82 % de similitud en la secuencia de aminoácidos con otras especies de Pseudomonas (Fig. 1 complementaria), lo que indica que BamA se conserva entre las especies de Pseudomonas. La secuencia de consenso obtenida (Fig. 1 complementaria) se usó como secuencia objetivo para el modelado de BamA. Dado que la proteína BamA está altamente conservada entre las especies Gram-negativas, la proteína BamA modelada se superpuso con la estructura PDB determinada experimentalmente de BamA de E. coli (5D0O) para determinar la similitud estructural. El valor RMSD del BamA modelado fue de 1,781 Å (Fig. 1A), lo que sugiere que el BamA modelado era estructuralmente similar al BamA de E. coli experimental (5D0O). Además, se trazaron y compararon los perfiles de puntuación DOPE de E. coli (5D0O) y Pseudomonas BamA modelada (Fig. 1B). Aunque los perfiles de puntuación DOPE de los modelos parecen bastante diferentes entre sí debido a la variación en las secuencias de aminoácidos, fueron similares entre los residuos de aminoácidos 360–480, que incluye la región de puerta lateral (residuos 400–410). Además, el BamA modelado también se validó con el análisis PROCHECK (Fig. 2 complementaria). El hallazgo mostró que la proteína BamA modelada estaba dentro de los criterios aceptables donde > 90 % de los residuos caían dentro de la región más favorecida. Además, la gráfica de Ramachandran (Fig. 2 complementaria) también predijo que el modelo consistía principalmente en láminas β con pequeños segmentos de hélice α que correspondían a las estructuras secundarias BamA y otras proteínas de la membrana externa. La estructura final de Pseudomonas BamA con una puerta lateral se muestra en la Fig. 1C. La darobactina se acopló a Pseudomonas BamA para determinar su sitio de unión. La estructura PDB experimental de E. coli (7P1C) y Pseudomonas BamA modelada unida a Darobactin se mostraron para comparación en la Fig. 1D. El sitio de unión similar en las estructuras tanto experimentales como modeladas valida aún más el modelo de Pseudomonas BamA.

Modelado estructural de Pseudomonas BamA. (A) Superposición de Pseudomonas BamA modelada (roja) y 5D00 E. coli BamA (blanca) que dan como resultado un valor RMSD de 1,781 Å. (B) Gráficos de puntuaciones DOPE de Pseudomonas BamA y 5D0O E. coli BamA que muestran la hebra β1 conservada en la puerta lateral. (C) Modelo final de Pseudomonas BamA y la puerta lateral resaltada (cian). (D) Pseudomonas BamA (rojo) y 7P1C (púrpura claro) muestran darobactina (azul) unida a la puerta lateral.

Las puntuaciones de HADDOCK para los 100 aptámeros obtenidos de 'Heredia F. DNA/Aptamer' se muestran en los Datos complementarios 1. De los 100 acoplamientos, se tabularon los ocho mejores complejos de aptámero-BamA con las puntuaciones de HADDOCK más negativas (Tabla 1) . Los complejos que obtuvieron una puntuación inferior a '-100' se seleccionaron como los mejores aptámeros de unión. Las puntuaciones negativas de HADDOCK indican que el complejo es energéticamente estable y la unión es favorable. Apt31 (Daunomicina 10.10v), el aptámero mejor calificado en la lista de puntajes HADDOCK, fue seleccionado para el análisis de acoplamiento global junto con Apt33 (Anti-Apple Stem Piting Virus MT32), que ocupó el primer lugar en la clasificación del algoritmo genético, y el oligonucleótido aleatorio (HTO008). La energía libre de Gibbs, las estructuras secundaria y terciaria de los tres aptámeros se muestran en la Tabla 2. Las interacciones no covalentes entre el aptámero y BamA, como las fuerzas de Van der Waals y los enlaces de hidrógeno, se identificaron mediante el análisis RING (Tabla 3). De acuerdo con la Tabla 3, Apt31 mostró las interacciones más altas donde el 44% de los residuos de aptámero interactuaron con BamA en comparación con solo el 8% de interacción para Apt33 y HTO008 respectivamente. El 44 % de la interacción en Apt31 incluyó interacciones entre ALA408 en BamA y T11 en Apt31 y VAL410 en BamA y A12 en Apt31 que son similares a los residuos del sitio de unión de la darobactina. Los residuos en la región de la puerta lateral que están involucrados tanto en la unión de Darobactin como de Apt31 se destacan en la Fig. 2A. El análisis de acoplamiento global utilizando el servidor HDOCK también reveló que Apt31 se une a la región de la puerta lateral, mientras que Apt33 y HTO008 se unen lejos de la puerta lateral (Fig. 2).

Acoplamiento molecular entre aptámeros y proteína BamA modelada. Acoplamiento molecular de (A) Apt31, (B) Apt33 y (C) HTO008 (Blanco) a la proteína BamA modelada. Apt31 se unió a la región de la puerta lateral de BamA, mientras que Apt33 y HTO008 se unieron a los sitios distantes de la puerta lateral. Los residuos de unión a darobactina en la puerta lateral que formaron interacciones no covalentes con Apt31 están resaltados (azul).

Después de que los vectores se normalizaron en base al % de 0 a 100 %, se observó que los mejores aptámeros potenciales (basados en la clasificación inicial) se extendían en su rango respectivo de puntajes normalizados. Idealmente, al igual que la puntuación HADDOCK, sus puntuaciones normalizadas deben agruparse en un modal gaussiano para mostrar alguna asociación con una buena unión aptámero-BamA, ya que la literatura respalda que cada uno de los cinco vectores tiene algún impacto en la afinidad de unión. Por lo tanto, como A2 y A5 tienen múltiples grupos de los mejores aptámeros con sus puntajes de vector más dispersos, se calcularon multimodales gaussianos para cada uno de los grupos más pequeños dispersos en el rango como en la Tabla complementaria 1.

Para obtener la mejor distribución de vectores HADDOCK dentro de los 100 aptámeros, que varían en capacidad y afinidad para unirse a BamA, se usaron como población inicial valores aleatorios de puntajes de vectores normalizados de 0 a 100%. Las puntuaciones normalizadas máximas posibles se obtuvieron después de los cálculos utilizando la ecuación de la función de pertenencia de Gauss. Para explorar los aptámeros potenciales capaces de unirse a BamA, los resultados de predicción del modelo propuesto se utilizaron como la población inicial de GA (Tabla complementaria 1). Al implementar estas secuencias como la población inicial y el valor máximo de cada multimodal en los vectores A2-A5, el AG pudo aprender la mejor distribución (o la mejor solución en términos de algoritmos genéticos) de los vectores A1-A5 en los mejores aptámeros. en la unión a BamA. La mejor distribución de los vectores HADDOCK es la siguiente: ([8.73009526, 1.91525757, 57.7832437, 36.83345299, 24.81401987]). El valor de aptitud de la mejor solución es 0,99934/1, que se considera una ejecución de GA de buen rendimiento, ya que los valores de aptitud de 0 a 1 suelen estar cerca de 0,9. El mejor valor de fitness se alcanzó después de 499 generaciones. Los parámetros de GA de los que obtuvo la mejor solución fueron num_generaciones = 500, num_parents_mating = 4, parent_selection_type = "random", crossover_type = "single point", mutación_type = "random".

En la Fig. 3A, es útil saber si el valor de un gen dura más generaciones, ya que es una indicación del mejor valor para este gen/vector HADDOCK. Por ejemplo, el valor aproximado de 8 para el gen 0 (también conocido como A1) duró más de 400 generaciones de 500. La Figura 3B resume cómo cambian los valores de aptitud de las soluciones en cada generación, por lo que el valor de aptitud alcanzó aproximadamente 0,9 en la generación 150 , mientras que aumentaba lentamente de 0,90 a 0,99934 de la generación 200 a la 500. Vale la pena señalar algunos parámetros de GA que influyeron en la eficacia de las carreras de GA, de los cuales la eficacia se refiere al tiempo necesario, un aumento constante en el valor de aptitud y la ausencia de resultados atípicos ( por ejemplo, valor de aptitud más allá de 1). Son los siguientes: cuando el valor asignado a sol_per_pop aumenta en un rango de 50 a 100, los valores de aptitud no van más allá de 1 o permanecen atascados en 0.49), sin embargo, a medida que aumenta la solución por población, el GA requeriría más tiempo para ejecutarse. . Además, num_generations cuando se mantuvo en 500, el tiempo necesario para una ejecución de GA completa fue de aproximadamente 4 minutos, mientras que num_generations en 100 toma dos minutos. Probamos num_generations a 1000 generaciones para observar cómo se podría maximizar el potencial de GA. La carrera de 1000 generaciones tomó aproximadamente 20 minutos y tuvo resultados de condición física más débiles en comparación con una carrera de 500 generaciones.

Algoritmo genético parcelas de la mejor distribución. (A) Resume cómo evoluciona la aptitud por generación para cada 'gen' (en este caso, el 'vector HADDOCK'). Los genes 0 a 4 se refieren a los vectores A1–A5 de HADDOCK. (B) Resume cómo los valores de aptitud de las soluciones cambian por generaciones.

Con base en la mejor distribución de los vectores HADDOCK, la fórmula de la distancia euclidiana clasificó los 100 aptámeros para observar qué tan cerca estaban los aptámeros de la "mejor distribución" (Datos complementarios 1). En general, Apt33 parece poseer la mejor distribución de vectores HADDOCK. La clasificación basada en GA para los complejos aptámero-BamA con las puntuaciones más negativas de HADDOCK se muestra en la Tabla 1.

Se usaron Apt31 (primero clasificado en puntajes HADDOCK), Apt33 (primero clasificado en clasificación GA) y HTO008 (oligonucleótido aleatorio) para el estudio in vitro para determinar el efecto de estos aptámeros en el crecimiento de P. aeruginosa mediante el uso de un método de placa de caída ( Figura 4A). Como se muestra en la Fig. 4B,C, el tratamiento de P. aeruginosa con 10 µM de Apt31 durante 2 h mostró una reducción significativa (p < 0,05) en UFC/mL y porcentaje de crecimiento. En la Fig. 4B, puede verse que las ufc/ml aumentaron con el tiempo de 0 a 2 h para Apt33, HTO008 y el grupo de control, pero no se observó ningún efecto en el grupo de tratamiento con Apt31. El porcentaje negativo de crecimiento sugiere que no hubo crecimiento y, al mismo tiempo, algunas células bacterianas estaban muriendo en presencia de Apt31. Vale la pena señalar que los efectos inhibitorios de Apt33 y HTO008 no fueron tan significativos (p> 0.05) como Apt31, ya que estos candidatos aptámeros exhibieron puntajes más altos de HADDOCK y se unieron lejos de la puerta lateral en el acoplamiento global. La concentración de ADN medida para el ensayo de fuga de ADN dependía únicamente del ADN liberado por las células bacterianas, ya que la purificación del sobrenadante eliminó por completo los aptámeros (Fig. 3 complementaria). Además de la inhibición del crecimiento, la concentración de ADN liberado también fue mayor para el grupo tratado con Apt31 en comparación con Apt33, HTO008 y el grupo de control (Fig. 4D). Esto sugiere que el tratamiento con Apt31 dio como resultado una integridad de membrana comprometida en las células de P. aeruginosa.

Efecto de los aptámeros en la supervivencia de P. aeruginosa. (A) Imágenes representativas del método de la placa de caída para el análisis de la actividad antibacteriana de los aptámeros en el crecimiento de P. aeruginosa. Cada placa representa diferentes puntos de tiempo (0, 1 y 2 h) a partir de la dilución 104 (derecha) a 109 (izquierda). (B) Unidad formadora de colonias (UFC/ml) de P. aeruginosa en presencia y ausencia de aptámeros 10 µM (n = 5). (C) Porcentaje de crecimiento de P. aeruginosa después de 1 y 2 h de incubación con y sin aptámeros. (D) Concentración de ADN liberado por P. aeruginosa después de 2 h de incubación con 10 μM de aptámeros que indica fuga de materiales citoplásmicos debido al daño de la membrana (n = 3). Los datos representan un promedio de tres experimentos independientes, ± SD mostrado por la barra de error; *valor de p < 0,05 y **valor de p < 0,01.

La detección computacional de fármacos potenciales está ganando interés, ya que ahorra tiempo y es rentable. En 2010, se informó que el descubrimiento de fármacos cuesta alrededor de 1800 millones de USD y tarda entre 10 y 15 años en llegar al mercado34, por lo que el descubrimiento de fármacos asistido por ordenador ha supuesto grandes avances en el campo farmacéutico durante décadas. Además, dado que la RAM va en aumento, es necesario identificar objetivos potenciales para las especies gramnegativas para superar esta crisis de salud. BamA es una proteína de membrana externa esencial altamente conservada que puede ser el objetivo de la inhibición del crecimiento bacteriano10. De acuerdo con la OMS, el descubrimiento de un nuevo agente antimicrobiano contra P. aeruginosa es necesario para tratar muchas infecciones nosocomiales. Por lo tanto, los aptámeros que se unen e inhiben la actividad de BamA pueden surgir como un potencial agente antimicrobiano.

Aunque BamA se conserva entre las especies Gram-negativas, P. aeruginosa mostró una distancia genética bastante grande de otras bacterias en el análisis filogenético26,27. La secuencia BamA también mostró una similitud de alrededor del 82% dentro del género Pseudomonas, lo que indica que está bien conservada entre la familia Pseudomonas. Por lo tanto, se construye un modelo universal de Pseudomonas BamA, que es beneficioso en el diseño de fármacos antibacterianos rentables y que ahorran tiempo contra varias especies de Pseudomonas. El modelo BamA estructurado utilizando tres plantillas estrechamente relacionadas por Modeller 10v1 mostró un valor RMSD de 1,781 Å cuando se superpuso con el modelo E. coli BamA de la base de datos PDB (5D0O). Esto indica que el modelo E. coli BamA y el modelo Pseudomonas BamA eran estructuralmente similares. Sin embargo, debido a la considerable variación en las secuencias de aminoácidos entre E. coli BamA y Pseudomonas BamA, los perfiles de puntuación de DOPE de estas dos estructuras fueron ligeramente diferentes entre sí. Sin embargo, los perfiles de puntuación de DOPE fueron similares entre los residuos de aminoácidos de 360 a 440, lo que sugiere que la hebra β1 en la región de puerta lateral de BamA en E. coli y Pseudomonas está conservada. Por lo tanto, los fármacos que se unen a la región de la puerta lateral en Pseudomonas BamA también pueden ser un fármaco potencial que se dirija a la puerta lateral en E. coli y otras especies Gram-negativas. Aparte de eso, el análisis PROCHECK del BamA modelado muestra que el 90 % de los residuos cayeron en la región más favorecida, lo que indica que es un modelo de buena calidad. La predicción de la estructura secundaria por el gráfico de Ramachandran también se comparó con el gráfico existente de BamA determinado experimentalmente y mostró que el modelo consiste principalmente en láminas plegadas β y algunas hélices α que están de acuerdo con la estructura secundaria de las proteínas de la membrana externa. El sitio de unión similar de Darobactin en los modelos experimental (7P1C) y Pseudomonas BamA valida aún más la precisión del modelo estructurado. El sitio de unión de la darobactina se utilizó como sitio activo en el acoplamiento HADDOCK 2.4, ya que este antibiótico se une a la puerta lateral de BamA y estabiliza una conformación de puerta lateral cerrada, lo que impide la entrada y salida de proteínas nacientes de la membrana externa13,14.

La base de datos Heredia F. DNA/Aptamer contiene todos los aptámeros de ADN no modificados publicados que son útiles en el enfoque de reutilización de aptámeros29. De los 100 acoplamientos, solo se seleccionaron los mejores complejos de aptámero-BamA con la puntuación más baja (la más negativa) de HADDOCK para el análisis in vitro. Del análisis HADDOCK 2.4 (acoplamiento local), se puede ver que Apt31 ocupó el primer lugar cuando se le permitió unirse a la región de la puerta lateral. Además, el análisis RING mostró que Apt31 exhibió alrededor del 44 % de las interacciones no covalentes, incluidas dos interacciones en los residuos similares al sitio de unión de la darobactina. Además, el servidor HDOCK (acoplamiento global) también predijo que la mejor posición y posición de unión para Apt31 en la proteína BamA es la región de la puerta lateral. Esto explica la razón detrás del mayor número de interacciones no covalentes entre BamA y Apt 31. Aunque Apt33 mostró una buena puntuación negativa de HADDOCK al clasificarse en el séptimo lugar de los 100 complejos de aptámero-BamA, no se unió alrededor de la región de la puerta lateral, lo que sugiere que esta unión puede no afectar a la actividad de BamA.

El análisis HADDOCK 2.4 consta de varios resultados, como la puntuación HADDOCK, RMSD de la estructura general de energía más baja, puntuación Z, energía de Van der Waals y energía electrostática. La mayoría de los estudios solo se centran en la puntuación HADDOCK cuando se estudia la unión a proteínas/fármacos. Aunque la puntuación HADDOCK indica los mejores complejos de aptámero-BamA mediante el cálculo de la suma ponderada de una variedad de términos de energía, incluidas las energías de van der Waals, electrostática, desolvatación y violación de restricción, en ocasiones no corresponde a la afinidad de unión del aptámero con el lateral. región de puerta. Por lo tanto, otras características o vectores, como los valores RMSD y Z-score, también deben considerarse en el análisis de acoplamiento para evitar sesgos. Los estudios de diseño de fármacos asistidos por ordenador han incorporado AG como parte de la optimización para identificar los fármacos con mejor rendimiento35. Además, GA también se usó en SELEX in vitro para seleccionar aptámeros de alta afinidad y especificidad36. Por primera vez, demostramos que se deben considerar múltiples factores en el acoplamiento de HADDOCK y esto se puede hacer clasificándolos utilizando el enfoque GA. Una limitación potencial presente en este análisis de GA, como lo destaca Wirsansky24, es que podría haber un riesgo de convergencia prematura, por lo que si la aptitud en una solución es mucho mayor que el resto de la población en las primeras generaciones, puede duplicarse a través de cruzarse y eventualmente cubrir a toda la población en las generaciones subsiguientes. Por lo tanto, el GA podría atascarse prematuramente en un valor máximo local. Por último, otra limitación que podría tener GA es una solución no garantizada, ya que generalmente GA se utiliza para proporcionar soluciones decentes en un tiempo razonable24.

La actividad antibacteriana de Apt31, Apt33 y HTO008 se determinó incubando células de P. aeruginosa con los aptámeros durante 1 y 2 h. Aunque Apt47 mostró una buena clasificación tanto en la puntuación HADDOCK como en el análisis GA además de unirse a la puerta lateral, la energía libre de Gibbs muy alta (1,44 kcal/mol) y la falta de una estructura secundaria bien definida predicha para esta secuencia por UNAFold pueden sugerir que Apt47 puede no exhibir una buena unión en BamA. Por lo tanto, Apt47 se excluyó del ensayo antibacteriano. La reducción significativa (p < 0,05) de UFC/mL y el crecimiento observado en las células bacterianas tratadas con Apt31 puede deberse a la inhibición de la actividad de BamA. El mecanismo exacto de cómo Apt31 redujo la supervivencia de P. aeruginosa sigue siendo desconocido. Sin embargo, dado que tanto el acoplamiento local como el global mostraron una fuerte unión de Apt31 a la región de la puerta lateral, Apt31 puede bloquear la entrada de proteínas de membrana externa nacientes a la región de la puerta lateral y evitar el plegamiento. La acumulación de proteínas de la membrana externa desplegadas puede conducir a la muerte celular37 y la falta de proteínas de la membrana externa también puede afectar la integridad de la capa de la membrana externa. La pérdida de integridad de la membrana da como resultado la fuga de materiales genéticos como el ADN38. Por lo tanto, la mayor concentración de ADN en el sobrenadante de las células tratadas con Apt31 indica que la falta de proteínas de la membrana externa debido a la inhibición de BamA resultó en una integridad y permeabilidad comprometidas de la capa de la membrana externa, lo que aumentó la fuga de ADN. Vale la pena señalar que el oligonucleótido aleatorio, HTO008 no mostró ningún efecto significativo (p > 0,05) sobre el crecimiento y la supervivencia de P. aeruginosa, así como sobre la pérdida de ADN en comparación con el control PBS. Aunque Apt33 ocupó el primer lugar en el análisis GA, no mostró ningún efecto significativo (p > 0,05) sobre el crecimiento bacteriano. Esto puede deberse a que su sitio de unión estaba más alejado de la región de la puerta lateral en el análisis de acoplamiento global. La clasificación de GA se basó en la salida de HADDOCK 2.4, que utiliza un enfoque de acoplamiento local en el que se debe especificar el sitio de unión en BamA. En condiciones naturales, el Apt33 podría unirse más lejos de la puerta lateral como lo implica el acoplamiento global que puede no inhibir la actividad de BamA. Además, la energía libre de Gibbs para Apt33 también es alta, lo que indica que el plegado es desfavorable y la estructura tiene poca estabilidad. Esto también puede explicar el efecto insignificante de Apt33 sobre el crecimiento de P. aeruginosa. En el futuro, los enfoques de acoplamiento locales y globales deben analizarse simultáneamente para obtener una unión de fármacos confiable y específica. Además, las técnicas de aprendizaje automático más avanzadas junto con el análisis de acoplamiento global y local pueden revelar los mejores aptámeros de unión a la región de la puerta lateral en BamA. El efecto antibacteriano de Apt31 se puede mejorar aún más realizando algunas modificaciones químicas en el aptámero para aumentar su afinidad y estabilidad de unión. La unión de Apt31 a BamA en P. aeruginosa con alta afinidad puede ser un desafío debido a la repulsión entre el aptámero cargado negativamente y la membrana externa cargada negativamente39. Además, las nucleasas producidas por bacterias también pueden degradar el aptámero, disminuyendo así su actividad antibacteriana. Por lo tanto, modificar los aptámeros, como reemplazar el enlace fosfodiéster del ADN con metilfosfonato, reducirá la carga negativa general de los aptámeros y facilitará la unión de los aptámeros a la proteína de la membrana externa40. La modificación del anillo de azúcar del nucleósido, como la sustitución de 2'-O-metilo en el aptámero, también puede resistir la degradación de la nucleasa y aumentar la termoestabilidad40.

Mostramos que el Apt31, un aptámero que se une a Daunomicina, es capaz de unirse a BamA en P. aeruginosa a través de un enfoque in silico. El acoplamiento local y global predijo que Apt31 se une a la puerta lateral de BamA con una fuerte interacción. Como prueba de esta predicción, Apt31 también mostró una reducción significativa (p < 0,05) en el crecimiento de P. aeruginosa. El enfoque de reutilización de aptámeros ahorra tiempo y dinero y es menos laborioso. La incorporación de técnicas de aprendizaje automático como GA tanto en SELEX in silico como in vitro puede aumentar la precisión y la especificidad de los aptámeros seleccionados. Además, centrarse en una proteína bien conservada en bacterias también amplía las aplicaciones terapéuticas entre diferentes grupos bacterianos. Por lo tanto, este estudio podría aprovecharse para obtener medicamentos antibacterianos rentables con un alto valor terapéutico en un corto período de tiempo.

Las secuencias de aptámeros de ADN sin modificar utilizadas en este proyecto con fines de acoplamiento están disponibles en https://github.com/eipm-uprm/Aptamer-ML y como conjunto de datos Heredia F. DNA/Aptamer en https://data.mendeley.com/ conjuntos de datos/76jgjbgndr/1.

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Este trabajo fue financiado por el Esquema de Financiamiento Estratégico de la Escuela de Ciencias 2021, Universidad Monash de Malasia.

Facultad de Ciencias, Universidad Monash de Malasia, Bandar Sunway, Selangor, Malasia

Rupany Selvam, Ian Han Yan Lim, Jovita Catherine Lewis, Michelle Khai Khun Yap y Hock Siew Tan

Escuela de Tecnología de la Información, Universidad Monash de Malasia, Bandar Sunway, Selangor, Malasia

Chern Hong Lim

Plataforma Multidisciplinaria de Medicina Tropical y Biología, Universidad Monash de Malasia, Bandar Sunway, Malasia

Corvejón Siew Tan

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JC modeló la estructura universal de Pseudomonas BamA e hizo el acoplamiento local. IL llevó a cabo el análisis GA y escribió el documento. RS escribió el artículo e hizo el acoplamiento global, el análisis RING y el ensayo antibacteriano in vitro, además de analizar e interpretar los datos generales. THS y MYKK supervisaron y administraron el proyecto. LCH corrigió el manuscrito y editó algunas partes. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Hock Siew Tan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Selvam, R., Lim, IHY, Lewis, JC et al. Selección de aptámeros antibacterianos contra la proteína BamA en Pseudomonas aeruginosa mediante la incorporación de un algoritmo genético para optimizar el método de detección computacional. Informe científico 13, 7582 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34643-5

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Recibido: 09 marzo 2023

Aceptado: 04 mayo 2023

Publicado: 10 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34643-5

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